记住可怕的房间，还是警惕危险的声音？杏仁核两条平行输出如何分工
小鼠研究解析中央外侧杏仁核PKCδ与SST两群神经元通向终纹床核腹侧的平行抑制通路，揭示它们对场景恐惧与声音线索恐惧的不同调节作用。
准确区分并维持与特定威胁相关的场景（contextual）和离散感官线索（cued/tone）恐惧记忆，对动物生存至关重要；扩展杏仁核（extended amygdala）中的中央杏仁核（CeA）与终纹床核（BNST）均深度参与恐惧与焦虑加工，但中央外侧杏仁核（CeL）内不同分子亚群如何通过特定下游通路分化调控不同类型的恐惧记忆仍不清楚。2023年9月9日，浙江大学医学院李晓明教授、陈家东教授团队在《Biological Psychiatry》发表题为“Distinct Circuits From the Central Lateral Amygdala to the Ventral Part of the Bed Nucleus of Stria Terminalis Regulate Different Fear Memory”的研究论文（朱毅、谢世泽、彭艾兵为共同第一作者）。研究综合运用狂犬病毒逆行单突触示踪、1型单纯疱疹病毒（HSV）顺行跨突触标记、脑片电生理记录、在体光遗传学操控及局部药理学阻断，阐明了PKCδCeL→vBNST与SSTCeL→vBNST两条并行抑制性通路在场景恐惧与声音线索恐惧记忆中的差异化功能及阿片肽受体共调节机制。
核心发现：中央外侧杏仁核（CeL）内的PKCδ+与SST+两类GABA能神经元均直接单突触支配终纹床核腹侧（vBNST）的GABA能与谷氨酸能神经元；持续光遗传学激活或抑制PKCδCeL→vBNST通路特异性削弱场景恐惧记忆，而操控SSTCeL→vBNST通路则主要削弱声音线索恐惧记忆；直接操控接收这两类输入的vBNST下游神经元可实现恐惧记忆的双向调控，且vBNST局部阻断δ与κ阿片受体能够逆转长时程激活CeL→vBNST通路所引起的恐惧记忆下降。
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跨突触病毒示踪与脑片膜片钳确立CeL的PKCδ+与SST+神经元向vBNST的直接抑制性投射
研究团队首先利用逆行跨单突触狂犬病毒示踪解析了CeL至vBNST的细胞类型特异性连接：向小鼠vBNST注射逆行AAV2/2Retro Plus-Syn-Cre，并在CeL注射Cre依赖的辅助病毒（AAV9-Ef1α-DIO-His-EGFP-2a-TVA与AAV9-Ef1α-DIO-RVG）及狂犬病毒RV-EnvA-ΔG-dsRed（图1A–D）。免疫荧光共标显示，逆行标记的CeL投射神经元中49.82%为蛋白激酶Cδ阳性（PKCδ+）神经元、35.67%为生长抑素阳性（SST+）神经元。进一步在PKCδ-Cre和SST-Cre小鼠CeL注射AAV9-DIO-mCherry进行顺行轴突追踪，证实两类神经元的轴突末梢均密集支配vBNST（图1E–J）。
双色逆行示踪（在vBNST注射CTB-488、在中央内侧杏仁核CeM注射CTB-555）表明，投射至vBNST的CeL神经元（43.30%）与仅投射至CeM的神经元（41.78%）基本分离，仅有14.92%存在双投射（图1K–M）。脑片全细胞膜片钳结合光遗传学记录（在PKCδ-Cre或SST-Cre小鼠CeL注射AAV9-DIO-ChR2-mCherry）显示，蓝光刺激vBNST内的PKCδCeL或SSTCeL轴突末梢，可在100%被记录的vBNST神经元上诱发出幅值超过1000 pA、潜伏期小于5 ms的光诱发抑制性突触后电流（oIPSCs），且该电流可被GABAA受体拮抗剂印防己毒素（picrotoxin）完全阻断（图1N–Q），证实PKCδCeL→vBNST与SSTCeL→vBNST均为高强度的单突触GABA能抑制性通路。
来源：Yi Zhu et al. · Biological Psychiatry · © Elsevier Inc.
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光遗传学操控PKCδCeL→vBNST与SSTCeL→vBNST通路分别选择性调控场景恐惧与声音线索恐惧
为探究这两条并行通路在恐惧记忆形成中的功能分工，研究团队在PKCδ-Cre与SST-Cre小鼠双侧CeL分别表达ChR2或NpHR，并在双侧vBNST上方植入光纤插芯，在巴甫洛夫线索恐惧条件化训练（conditioning）全程实施在体光遗传学调控（图2A–H）。实验发现，在训练全程施加蓝光激活（ChR2，2s-on-1s-off）或持续黄光抑制（NpHR），操纵PKCδCeL→vBNST投射末梢选择性降低了小鼠次日场景恐惧提取（context recall）中的僵直（freezing）水平而不影响声音线索恐惧提取（tone recall）；而训练全程操纵SSTCeL→vBNST投射末梢则同时降低了次日场景恐惧与声音线索恐惧提取水平。
为进一步精确拆分刺激时间窗（原论文图3A–I），研究团队在不含声音线索的纯场景恐惧条件化（或仅限于电击后间隔期）中实施光遗传学操控，发现激活或抑制PKCδCeL→vBNST末梢依然显著削弱场景恐惧记忆，而操控SSTCeL→vBNST末梢则不影响纯场景恐惧记忆（图3A–F）；相反，若仅在4次30秒声音CS呈现期间特异激活SSTCeL→vBNST末梢（tone-specific ChR2），则选择性增强了声音线索恐惧记忆提取而不影响场景恐惧（图3G–I），揭示了两条通路在场景恐惧与声音线索恐惧编码中的精细时间窗分工。
来源：Yi Zhu et al. · Biological Psychiatry · © Elsevier Inc.
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顺行跨突触特异标记并操控vBNST突触后神经元实现恐惧记忆的双向调节
为直接检验下游vBNST突触后神经元在恐惧记忆中的因果作用，研究团队利用顺行跨单突触腺相关病毒（scAAV1-DIO-Flp）结合狂犬病毒单突触验证技术，在PKCδ-Cre或SST-Cre小鼠CeL注射scAAV1-DIO-Flp，并在vBNST注射Flp依赖的AAV-fDIO-ChR2或AAV-fDIO-NpHR，从而选择性操控接收PKCδCeL或SSTCeL输入的vBNST突触后神经元（图4A–H）。
行为学测试表明，直接光遗传学激活（fDIO-ChR2）接收PKCδCeL输入的vBNST突触后神经元显著降低了场景恐惧提取僵直，而抑制（fDIO-NpHR）该群vBNST神经元则显著增强了场景恐惧记忆（对声音线索恐惧均无显著影响，图4A–D）；与此同时，直接光遗传学激活或抑制接收SSTCeL输入的vBNST突触后神经元，则能够对场景恐惧与声音线索恐惧记忆均产生双向调控作用（激活减弱恐惧、抑制增强恐惧，图4E–H），证明下游vBNST靶神经元本身的活性对恐惧记忆呈明确的双向负向门控关系。
来源：Yi Zhu et al. · Biological Psychiatry · © Elsevier Inc.
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CeL→vBNST环路富集δ与κ阿片受体，局部阻断阿片受体逆转长时程通路激活诱发的恐惧记忆下降
由于CeL的PKCδ+与SST+神经元除释放GABA外还共表达脑啡肽与强啡肽，高分辨免疫荧光共聚焦成像（原论文图5A–N）证实，δ-阿片受体（δOR）富集于PKCδCeL胞体（约54.8%）及其vBNST内的突触素阳性（Synaptophysin+）轴突终扣，而κ-阿片受体（κOR）则显著富集于SSTCeL胞体（约45.2%）及其vBNST轴突终扣。脑片全细胞膜片钳记录进一步揭示（图6A–N），联合应用δOR拮抗剂Naltrindole（2 μM）与κOR拮抗剂nor-Binaltorphimine（100 nM）可显著增大单脉冲光诱发oIPSC幅值并降低50 ms配对脉冲比（PPR）；更重要的是，Naltrindole可特异逆转PKCδCeL→vBNST通路在5 Hz光刺激串下的oIPSC短期衰减（图6F–G），而nor-Binaltorphimine则特异逆转SSTCeL→vBNST通路在20 Hz光刺激串下的oIPSC衰减（图6M–N）。
为在体验证这一分子机制，研究人员在PKCδ-Cre与SST-Cre小鼠双侧vBNST植入引导套管与光纤，在训练期蓝光激活通路前向vBNST局部微量注射阿片受体拮抗剂混合液（Naltrindole 2.5 μg/side + nor-Binaltorphimine 1.25 μg/side，图6O–S）。药理学阻断vBNST内阿片受体完全逆转了PKCδ::DIO-ChR2CeL激活所导致的场景恐惧记忆下降（图6P–Q），并恢复了SST::DIO-ChR2CeL激活所引起的情景与声音线索恐惧记忆提取（图6R–S）。
来源：Yi Zhu et al. · Biological Psychiatry · © Elsevier Inc.
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超越中央外侧杏仁核局部互抑：双平行投射独立编码线索与场景恐惧记忆
经典恐惧记忆模型通常认为，中央外侧杏仁核（CeL）内的生长抑素阳性（SOM+）神经元与蛋白激酶 C-δ 阳性（PKC-δ+）神经元主要通过局部微环路的相互抑制（即“Fear-On”与“Fear-Off”跷跷板机制），经由中央内侧杏仁核（CeM）调控恐惧表达。然而本研究系统证明，投射至终纹床核腹侧部（vBNST）的 SOMCeL→vBNST 与 PKCδCeL→vBNST 神经元均直接对 vBNST 内的 GABA 能神经元形成功能性单突触抑制性连接，无需依赖局部 CeL 互抑即可在下游靶区对恐惧行为施加双向调控。
更重要的是，由于 δ 型与 κ 型阿片受体在 CeL→vBNST 环路中的亚型富集分布，高频轴突激活触发的内源性阿片肽共释放可通过突触前 δOR/κOR 负反馈抑制後續 GABA 释放，从而与直接抑制末梢产生相似的去抑制中断效应。这一平行长程投射与递质—神经肽共调节框架，阐明了线索性恐惧与场景性恐惧在杏仁核—终纹床核轴上的分离机制，也为创伤后应激障碍中恐惧记忆异常提供了新的神经环路干预靶点。