夜幕降临后，褪黑素如何在丘脑室旁核帮小鼠安静入睡？
研究在保留内源性褪黑素合成能力的C3H/HeJ小鼠中，发现褪黑素通过丘脑室旁核MT1与MT2受体压低觉醒相关神经元活动，促进非快速眼动睡眠。
松果体分泌的褪黑素（melatonin，MLT）是协调昼夜节律与睡眠稳态的关键神经内分泌激素，其外源性补充剂及受体激动剂已在临床上广泛用于改善入睡困难与节律紊乱。然而，内源性褪黑素究竟直接作用于脑内哪个觉醒—睡眠调控核团来促进睡眠，长期以来众说纷纭。造成这一机制空白的一个重要原因在于，实验室最常用的近交系小鼠（如C57BL/6J）因芳基烷基胺N-乙酰转移酶（AANT）基因发生天然截短突变，本身缺乏合成内源性褪黑素的能力，难以真实反映内源性褪黑素信号对睡眠结构的影响。2024年8月，陆军军医大学基础医学院生理学教研室任栓成、胡志安、何超团队在《Current Biology》发表研究论文，专门选用具备完整内源性褪黑素合成机制的C3H/HeJ品系小鼠，系统解析了丘脑室旁核（PVT）在褪黑素促睡眠效应中的核心地位。研究证实，PVT神经元高表达呈昼夜节律振荡的褪黑素受体MT1R与MT2R；褪黑素通过突触后MT1R/MT2R直接超极化并抑制促觉醒PVT神经元的自发放电与钙活动，从而在昼夜转换等关键时间窗强力促进非快速眼动（NREM）睡眠。
在具备完整内源性褪黑素合成能力的C3H/HeJ小鼠中，褪黑素通过激活丘脑室旁核（PVT）神经元上的MT1R与MT2R产生直接突触后抑制效应，降低PVT钙活动与动作电位发放，进而促进并维持非快速眼动（NREM）睡眠。
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丘脑室旁核高表达褪黑素受体MT1R与MT2R且呈昼夜动态波动
丘脑室旁核（PVT）是团队此前率先确立的关键丘脑促觉醒中心，不仅与视交叉上核（SCN）存在密切的神经投射联系，而且紧邻第三脑室，直接浸润在富含松果体褪黑素的脑脊液环境中。为了明确PVT是否具备直接感知褪黑素信号的分子基础，研究团队在12小时光照/12小时黑暗周期饲养的成年雄性C3H/HeJ小鼠中，选取开灯时刻（ZT0）、光照中期（ZT6）、关灯时刻（ZT12）和暗期中期（ZT18）四个时间点，对跨越PVT前后轴的四个冠状切面（Bregma -1.23、-1.43、-1.79和-2.03 mm）进行了系统的免疫荧光定量分析。
染色结果显示，两种G蛋白偶联褪黑素受体MT1R和MT2R均在PVT全长范围内密集分布，且其蛋白荧光强度呈现出显著的昼夜节律性变化：在光照期中段（ZT6，即小鼠深度睡眠期），PVT内的MT1R和MT2R蛋白表达量达到全天峰值，显著高于ZT0和ZT18。进一步的RNAscope原位杂交（针对编码MT1R的MTNR1A和编码MT2R的MTNR1B）及实时定量PCR验证表明，两种受体的mRNA转录水平同样在ZT6达到高峰，且PVT神经元中MTNR1A的表达丰度明显高于MTNR1B。这种受体表达随昼夜节律动态调整的特征，提示PVT对褪黑素的敏感性受到生物钟的精细调控。
来源： et al. · Current Biology · Original figure reproduced for academic literature review under fair scholarly commentary; copyright remains with the authors/publisher.
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褪黑素通过突触后MT1R与MT2R协同超极化并抑制PVT神经元
为了直接检验褪黑素对PVT神经元电活动的影响，研究团队制备了C3H/HeJ小鼠的急性PVT冠状脑片并进行全细胞电流钳记录。在灌流液中梯度加入不同浓度的外源性褪黑素（10 pM、100 pM、1 nM和10 nM）后，PVT神经元的自发动作电位发放频率呈现出明显的浓度依赖性降低，同时伴随静息膜电位的显著超极化，其中10 nM浓度可诱发最强的放电抑制与膜电位超极化效应，洗脱后神经元放电活动可恢复至基线水平。
为了区分这种抑制作用是源于突触前输入改变还是突触后直接作用，研究团队在人工脑脊液中同时加入AMPA受体阻断剂DNQX（10 μM）、NMDA受体阻断剂AP5（50 μM）以及GABAA受体阻断剂印防己毒素（picrotoxin，100 μM）以阻断兴奋性和抑制性突触传递。在此条件下，10 nM褪黑素依然能够显著降低PVT神经元的放电频率并使其膜电位超极化，证实褪黑素直接作用于PVT神经元突触后膜。受体药理学剖析进一步显示，单独预孵育高选择性MT2R拮抗剂4P-PDOT（1 μM）可部分削弱褪黑素的抑制效应，而单独给予高选择性MT1R拮抗剂S26131（1 μM）或同时联合应用S26131与4P-PDOT则能完全消除褪黑素诱导的放电抑制与超极化，表明MT1R在介导PVT神经元抑制中发挥主导作用，并与MT2R协同生效。
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在体局部给药证实褪黑素实时压制自由活动小鼠PVT钙信号与单细胞放电
离体脑片的电生理抑制能否在自由活动的完整动物脑内重现？研究团队首先在暗期起始时刻（ZT12，小鼠自然觉醒高峰期）通过预埋套管向PVT局部微量注射褪黑素（2 pmol，200 nL），3小时后灌注取脑发现，PVT内的c-Fos阳性神经元数量由对照溶剂组的373 ± 26个显著下降至177 ± 9个（p < 0.001）。为了高时间分辨率地追踪给药前后的群体神经元实时动态，研究团队在PVT注射表达钙指示剂AAV-CaMKIIα-GCaMP6s，并植入定制的给药套管—光纤一体组件，利用光纤记录系统同步采集470 nm钙信号与410 nm等吸收参考信号。在体记录显示，局部注入褪黑素后，PVT谷氨酸能神经元的平均钙信号荧光幅度（ΔF/F）显著下降（由对照组的+0.85% ± 0.93%降至-6.85% ± 1.23%，p < 0.001），自发钙瞬变事件频率也从给药前的11.86 ± 0.51次/分钟显著降低至7.14 ± 0.83次/分钟。
与此同时，研究团队利用与给药套管耦联的多通道四联体电极（tetrodes）在自由活动小鼠PVT中记录到了69个单神经元放电单元（single units）。在体电生理分析表明，局部微注褪黑素使其中49个（占比71.0%）PVT神经元的自发放电受到显著抑制，仅有7个（10.1%）表现为兴奋，13个（18.9%）无明显变化；群体平均放电频率由给药前的1.7 ± 0.3 Hz大幅下降至0.7 ± 0.2 Hz（p < 0.001）。组织学荧光蛋白、光纤记录与多通道单细胞电生理三重证据相互印证，确立了褪黑素在活体条件下对PVT神经元的强效抑制作用。
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PVT局部给药双向调控非快速眼动睡眠与觉醒时长
在明确褪黑素能够抑制促觉醒PVT神经元后，研究团队通过脑电（EEG）与肌电（EMG）多导睡眠监测，评估了PVT局部褪黑素信号对睡眠—觉醒结构的调控效应。在暗期开始（ZT12）向PVT微量注入外源性褪黑素（2 pmol），可在随后3小时内使小鼠的累计非快速眼动（NREM）睡眠时间大幅增加51.01%（p = 0.004），觉醒时间相应减少22.24%（p = 0.002），而快速眼动（REM）睡眠时长与脑电功率谱密度均未发生显著改变。睡眠结构细分显示，褪黑素主要通过延长单次NREM睡眠片段的平均持续时间（p = 0.049）来巩固睡眠，而非增加睡眠片段的发生次数。作为解剖学对照，将同等剂量的褪黑素注入同样表达褪黑素受体的邻近丘脑腹基底核群（VB），则对睡眠和觉醒状态毫无影响，突显了PVT在介导褪黑素促睡眠效应中的核团特异性。
反之，为了检验生理状态下内源性褪黑素作用于PVT是否维持了正常睡眠，研究团队在光照期开始（ZT0，小鼠进入睡眠期）向PVT局部注入MT1R与MT2R联合拮抗剂（S26131 + 4P-PDOT，0.1 mM）。药理学阻断PVT内的内源性褪黑素受体信号后，小鼠在随后3小时内的累计觉醒时间激增51.42%（p < 0.001），累计NREM睡眠时间显著缩减29.03%（p < 0.001），并伴随单次觉醒片段持续时间的显著延长（p = 0.013），而REM睡眠依然保持不变。一正一反的药理学干预共同证明，PVT中的褪黑素受体信号对NREM睡眠具有双向调节能力。
敲减PVT褪黑素受体削弱全天NREM睡眠并破坏昼夜转换期睡眠稳态
为了进一步阐明慢性生理条件下PVT内源性褪黑素受体对全天睡眠稳态的贡献，研究团队将靶向MTNR1A和MTNR1B的两种自互补腺相关病毒（ScAAV-U6-shRNA-MTR1A-CMV-EGFP与ScAAV-U6-shRNA-MTR1B-CMV-EGFP）联合注射至C3H/HeJ小鼠的PVT中（简称shMTR组），以同步敲减局部MT1R与MT2R表达。连续24小时的脑电与肌电监测显示，与注射乱序对照病毒的shCTRL小鼠相比，shMTR小鼠在全天24小时周期内的总觉醒比例显著升高（54.07% ± 1.25% 对比 47.69% ± 1.48%，p = 0.003），总NREM睡眠比例则显著下降（48.53% ± 4.17% 对比 56.73% ± 2.50%，p = 0.009）。
更为细致的分时段动力学分析揭示，shMTR小鼠的睡眠缺失并非均匀分布在全天，而是高度集中于两个昼夜转换的3小时窗口以及受体表达高峰期：在暗期刚刚开启的ZT12–15时段（对应松果体褪黑素分泌开始上升的窗口），shMTR小鼠的觉醒时间显著增加、NREM睡眠大幅减少（p < 0.001），表现为单次觉醒片段显著延长且NREM睡眠片段数量减少；同样，在光照期刚刚开启的ZT0–3时段（小鼠由活动期转入休息期的关键过渡窗）以及受体表达达到峰值的ZT6前后，shMTR小鼠也表现出显著的觉醒增多与NREM睡眠受损（ZT0–3时段还伴随REM睡眠轻度下降，p = 0.011）。这一结果说明，内源性褪黑素正是通过作用于PVT受体，在昼夜交替的关键过渡期及时为促觉醒系统“踩下刹车”。
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连接生物钟激素信号与丘脑觉醒门控的神经环路桥梁
尽管褪黑素在哺乳动物中并非睡眠发生的绝对必需品，但缺乏内源性褪黑素如何精细调节睡眠—觉醒转换的核团机制长期困扰着睡眠神经生物学界。本研究刻意避开传统褪黑素缺陷型C57BL/6J小鼠，在保留完整褪黑素合成通路的C3H/HeJ小鼠中展开系统攻关，发现紧邻第三脑室的丘脑室旁核（PVT）同时整合了每日褪黑素分泌节律与自身MT1R/MT2R表达节律：在光照期中段（ZT6），PVT受体高表达与基底褪黑素协同维持高水平的日间NREM睡眠；而在暗期初（ZT12–15）和光照期初（ZT0–3）等昼夜转换窗口，内源性褪黑素信号则有效缓冲了PVT的过度觉醒驱动，防止觉醒片段异常延长。
从临床转化视角来看，PVT不仅主导觉醒维持，还深度参与慢性应激、焦虑、疼痛及成瘾戒断引发的高觉醒与失眠状态。明确褪黑素通过突触后MT1R/MT2R直接抑制PVT谷氨酸能神经元的分子与环路机制，不仅为理解外源性褪黑素及雷美替胺（ramelteon）等受体激动剂的促睡眠药理作用提供了精确的解剖靶点，也为针对过度觉醒型失眠开发高选择性靶向干预策略奠定了坚实的理论基础。