瘙痒（itch）诱发强烈的搔抓反射，而过度搔抓又会造成皮肤屏障损伤并形成“痒-抓循环”（itch-scratch cycle）。前扣带回皮层（ACC）是调控痛觉与痒觉的高级皮层中枢：既往研究显示尾侧前扣带回（cACC）主要发挥易化组织胺性及慢性瘙痒的作用，但吻侧前扣带回（rACC）中的兴奋性锥体神经元（rACC）在瘙痒加工中究竟扮演何种角色、又通过哪一下行通路调控脑干中继核团，此前尚不明确。 2024年12月11日，陆军军医大学基础医学院隋建峰教授、李红丽教授与武广燕副教授团队在《Cell Reports》发表题为“An excitatory neural circuit for descending inhibition of itch processing”的研究论文。研究结合c-Fos Tet-Off活动印迹标记系统、在体光纤钙成像、狂犬病病毒（RV）单突触逆行追踪、光遗传学与跨突触WGA-Cre化学遗传学操控，在大鼠模型中系统阐明了瘙痒标记的rACC锥体神经元（itch-tagged rACC）通过单突触优先激活导水管周围灰质GABA能神经元（PAG GABA）、对急性组胺性与非组胺性瘙痒实施下行抑制的微环路机制。

01 / 瘙痒反应神经元捕获与在体钙动态

c-Fos Tet-Off标记的rACC锥体神经元在搔抓周期中呈现锁时钙信号下降

研究团队首先在大鼠双侧rACC中测试了总体锥体神经元（rACC）的在体反应与功能，发现在颈背部或面颊部注射5-羟色胺（5-HT）、化合物48/80（compound 48/80）或氯喹（chloroquine）诱发搔抓期间，rACC神经元的钙信号显著下降；化学遗传学或光遗传学激活rACC神经元可显著减少搔抓回合数与累计搔抓时长，而不影响平衡木、旷场或转棒运动功能，抑制rACC神经元则显著加剧搔抓（Figures S2–S7）。

鉴于仅有一部分rACC神经元在瘙痒刺激下被激活，作者进一步采用c-Fos Tet-Off系统（在rACC共注射rAAV2/9-CaMKIIα-Cre、rAAV2/9-c-Fos-DIO-tTA及rAAV2/9-PTRE-tight-jGCaMP7s），在撤除多西环素（Off Dox）3天后面颊部注射5-HT，特异性给瘙痒反应性rACC神经元打上jGCaMP7s标签（itch-tagged rACC）。在体光纤光度记录表明，无论是颈背部注射5-HT、compound 48/80，还是面颊部注射5-HT、compound 48/80或氯喹，这群瘙痒标记的rACC神经元在每次搔抓序列（scratching train）发生期间均表现出显著且可重复的钙信号（ΔF/F）下降。

原论文图 1图1 | 瘙痒标记的rACC锥体神经元在搔抓序列发生期间钙活动显著下降

02 / 印迹神经元双向因果调控

化学遗传学重激活瘙痒标记的rACC神经元广泛抑制组胺与非组胺性瘙痒

为检验这群瘙痒标记的rACC神经元是否直接参与下行止痒，作者利用c-Fos Tet-Off系统将兴奋性受体hM3Dq-mCherry或抑制性受体hM4Di-mCherry特异性表达于5-HT瘙痒激活的rACC神经元中。行为学结果显示，腹腔注射CNO重激活这群itch-tagged rACC神经元，可显著减少大鼠面颊部注射5-HT、颈背部注射5-HT、颈背部注射compound 48/80以及面颊部注射氯喹所诱发的搔抓回合数与累计搔抓时长；而在不注射CNO的对照测试中，hM3Dq组与mCherry组之间无显著差异。

相反，通过hM4Di化学遗传学抑制这群瘙痒标记的rACC神经元，则显著增加了5-HT、compound 48/80及氯喹诱发的搔抓回合数与累计搔抓持续时间（Figure S8）。这证明瘙痒反应性rACC神经元亚群对不同致痒剂诱发的痒觉加工均具有显著的双向调控能力。

原论文图 2图2 | 化学遗传学重激活瘙痒标记的rACC神经元显著抑制搔抓行为

03 / 皮层-脑干下行投射解析

rACC第5层锥体神经元向导水管周围灰质（PAG）发出密集投射并在瘙痒中激活

为寻找rACC神经元发挥下行止痒作用的脑干靶区，研究团队在右侧rACC注射顺行示踪病毒rAAV2/9-CaMKIIα-ChR2-mCherry，观察到mCherry阳性的rACC轴突纤维在导水管周围灰质（PAG）沿吻尾轴各冠状层面均有密集分布。逆行示踪剂CTB-555注射至PAG后，逆行标记的神经元集中分布于rACC第5层（Layer 5），且几乎全部与CaMKIIα共标而不与GAD67共标（Figure S9）。

同时，CTB-555逆行追踪结合c-Fos免疫荧光显示，瘙痒刺激后投射至PAG的rACC神经元中c-Fos双标比例显著高于对照组（Figure S10）。全群投射操控实验证实，化学遗传学激活投射至PAG的rACC神经元可显著抑制5-HT、compound 48/80和氯喹诱发的搔抓，而抑制该投射通路则显著促进搔抓（Figures S11–S12）。

原论文图 3图3 | rACC锥体神经元向PAG各节段发出密集轴突投射

04 / 通路特异性印迹神经元操控

特异性重激活投射至PAG的瘙痒标记rACC神经元抑制搔抓行为

进一步地，作者将逆行病毒与c-Fos Tet-Off系统相结合：在双侧PAG注射逆行rAAV2-retro-CaMKIIα-Cre，同时在双侧rACC注射Cre依赖的rAAV2/9-c-Fos-DIO-tTA与rAAV2/9-PTRE-tight-hM3Dq-mCherry（或hM4Di-mCherry），从而专门捕获并操控“既投射至PAG、又在瘙痒刺激下激活”的rACC神经元亚群。

行为学测试表明，CNO重激活这群投射至PAG的瘙痒标记rACC神经元，同样显著压低了5-HT、氯喹和compound 48/80诱导的搔抓回合数与累计搔抓时长；而在无CNO条件下两组无差异。反之，化学遗传学抑制这群神经元则显著加剧了上述致痒剂诱发的搔抓反应（Figure S13）。

原论文图 4图4 | 化学遗传学重激活投射至PAG的瘙痒标记rACC神经元抑制多种致痒剂诱发的搔抓反应

05 / 狂犬病病毒单突触连接与细胞靶向

rACC神经元单突触支配PAG神经元，且瘙痒激活亚群优先投射至PAG GABA能神经元

既往研究表明，PAG内的谷氨酸能神经元（PAG Glu）易化瘙痒，而GABA能抑制性中间神经元（PAG GABA）则通过局部抑制PAG Glu神经元发挥止痒作用。为解析rACC→PAG的突触连接规则，研究团队在PAG内分别以VGAT1-Cre或VGLUT2-Cre驱动辅助病毒与EnvA假型狂犬病病毒（RV-EnvA-ΔG-EGFP），开展细胞类型特异性的逆行跨单突触追踪。

结果显示，无论是以PAG GABA还是以PAG Glu作为起始神经元（starter neurons），均可在rACC内观察到大量逆行跨单突触标记的EGFP阳性神经元，且这些神经元与CaMKIIα共标而不与GAD67共标。更重要的是，在瘙痒刺激后，从PAG GABA起始神经元逆行追踪到的rACC神经元中c-Fos/EGFP双阳性比例显著高于从PAG Glu追踪到的神经元（Figure S15），证实瘙痒激活的rACC神经元优先向PAG GABA神经元发送单突触兴奋性输入。

原论文图 5图5 | 狂犬病病毒逆行跨单突触追踪证实rACC神经元直接支配PAG GABA神经元

06 / 下游微环路光遗传学验证与跨突触操控

光激活瘙痒标记rACC神经元兴奋PAG GABA并抑制PAG Glu，直接激活突触后PAG GABA抑制瘙痒

为在体检验rACC输入对PAG两类神经元的相反调控作用，作者在瘙痒标记的rACC神经元中表达ChR2-mCherry，同时在PAG GABA或PAG Glu神经元中表达jGCaMP7s进行光纤钙记录。10 Hz与20 Hz蓝光刺激瘙痒标记的rACC神经元可诱发PAG GABA神经元钙信号显著升高（Figure 6），却引起PAG Glu神经元钙信号显著下降（Figure S16），直接印证了“rACC优先激活PAG GABA进而前馈抑制PAG Glu”的微环路机制。

最后，作者在双侧rACC注射顺行跨突触融合蛋白病毒rAAV2/9-CaMKIIα-WGA-Cre，并在PAG注射受GAD67启动子调控的Cre依赖性病毒rAAV2/9-GAD67-DIO-hM3Dq-mCherry（或hM4Di）。化学遗传学特异性激活受rACC支配的突触后PAG GABA神经元，显著抑制了颈背部与面颊部5-HT、compound 48/80及氯喹诱发的搔抓行为（Figure 7），而抑制该群神经元则显著易化搔抓（Figure S17）。综上，该研究确立了rACC→PAG GABA兴奋性下行环路在瘙痒抑制中的关键作用，并揭示了吻侧（rACC，抑痒）与尾侧（cACC，促痒）前扣带回在瘙痒调控中的功能分异。

原论文图 7图7 | 化学遗传学激活受rACC支配的突触后PAG GABA神经元强效抑制搔抓行为