胆汁酸信号如何牵动情绪回路？从外侧下丘脑到海马的三级连接
雄性小鼠研究追踪慢性应激下外侧下丘脑TGR5受体的变化，解析其通过钾通道与海马—外侧隔核通路调节抑郁样行为的机制。
2024年3月21日，中国药科大学唐苏苏、洪浩团队联合浙江大学医学院附属精神卫生中心（杭州市第七人民医院）王昊团队在《Neuron》发表题为“TGR5-mediated lateral hypothalamus-dCA3-dorsolateral septum circuit regulates depressive-like behavior in male mice”的研究论文（李旭懿、张诗雅为共同第一作者）。该研究综合运用在体光纤光度钙成像、光遗传学与化学遗传学操控、跨突触病毒示踪及全细胞膜片钳电生理记录（研究采用Inper套管光纤开展465 nm/589 nm在体光遗传学刺激，并结合Inper双色光纤记录系统及Inper Studio/Inper Data Process软件采集分析在体钙信号），系统阐明了慢性应激通过糖皮质激素受体（GR）结合负性糖皮质激素反应元件（nGREs）及降低胆汁酸水平，共同下调外侧下丘脑区（LHA）GABA能神经元中的武田G蛋白偶联受体5（TGR5）；而激活或过表达LHA GABA能神经元TGR5可通过抑制ERK磷酸化、恢复Kv4.2介导的A型钾电流以降低神经元过度兴奋，进而解除对背侧海马CA3区（dCA3）CaMKIIα能神经元投射至背外侧隔核（DLS）GABA能神经元通路的抑制，发挥显著的抗抑郁作用。
慢性应激通过糖皮质激素受体（GR）负性转录调控及胆汁酸耗竭下调外侧下丘脑区（LHA）GABA能神经元的TGR5表达，经由p-ERK升高与Kv4.2钾通道功能受损引发神经元高兴奋性；激活LHA GABA能神经元TGR5可恢复Kv4.2介导的A型钾电流，解除LHAGABA→dCA3CaMKIIα单突触抑制并增强下游dCA3CaMKIIα→DLSGABA兴奋性输出，从而逆转抑郁样行为。
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慢性应激通过胆汁酸减少与GR-nGRE转录抑制下调外侧下丘脑GABA能神经元TGR5
研究团队首先在10天慢性社会挫败应激（CSDS）与21天慢性束缚应激（CRS）两种雄性小鼠抑郁模型中检测了外侧下丘脑区（LHA）TGR5的表达变化。免疫荧光、Western blot与qRT-PCR结果显示，CSDS易感（Susceptible）小鼠及CRS小鼠LHA内的TGR5蛋白与mRNA水平均较对照组与韧性（Resilient）小鼠显著下降，且LHA的TGR5蛋白表达量与社交互动比率（SI ratio）及蔗糖偏好率（SPT）呈显著正相关。双标免疫荧光证实，正常小鼠LHA内92.73% ± 6.30%的TGR5阳性细胞与GABA共标，仅11.34% ± 5.31%与CaMKIIα共标，且慢性应激特异性降低了LHA GABA能神经元中的TGR5表达。
为解析TGR5下调的上游机制，作者利用UPLC-MS/MS靶向代谢组学发现CSDS易感小鼠和CRS小鼠血清及下丘脑中的总胆汁酸与多种胆汁酸亚型（如胆酸CA、鹅脱氧胆酸CDCA等TGR5内源性激动剂）水平显著降低；外源性补充CA或CDCA可上调LHA中TGR5的表达并改善抑郁样行为。与此同时，应激小鼠血清和下丘脑皮质酮（CORT）显著升高，促使LHA内糖皮质激素受体（GR）向细胞核转位；染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实，核转位的GR直接结合于TGR5基因启动子区的负性糖皮质激素反应元件（nGRE1/nGRE2）从而抑制TGR5转录，而系统给予GR拮抗剂RU486可阻断GR核转位并恢复LHA内TGR5的表达水平。
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外侧下丘脑GABA能神经元在慢性应激后过度激活并双向调控抑郁样行为
全脑c-Fos免疫荧光筛查显示，CSDS易感小鼠LHA区的c-Fos阳性细胞数显著增加，且增高的c-Fos主要局限于GABA能神经元中。研究团队在GAD2-Cre小鼠LHA区注射AAV-DIO-GCaMP6s并结合在体光纤光度记录（通过Inper Studio与Inper Data Process软件采集分析488 nm激发钙信号与405 nm等吸收参考信号）发现，当易感小鼠在社交互动测试中进入装有CD1攻击鼠的社交区域时，LHA GABA能神经元表现出显著增强的钙瞬变（0–15 s曲线下面积AUC显著升高），而在无目标物阶段或面对同品系C57小鼠时无此差异；全细胞电流钳记录进一步证实，CSDS易感小鼠与CRS小鼠LHA GABA能神经元的注入电流诱发动作电位发放频率显著升高。
为验证LHA GABA能神经元活性与抑郁样行为的因果关系，作者在GAD2-Cre小鼠LHA中分别表达兴奋性hM3Dq或抑制性hM4Di化学遗传学受体。腹腔注射CNO（2 mg/kg）特异性激活正常小鼠LHA GABA能神经元，可直接诱导出社交回避、悬尾测试（TST）不动时间延长及蔗糖偏好率下降等典型抑郁样表型；相反，在CSDS易感小鼠或CRS小鼠中化学遗传学抑制LHA GABA能神经元，则能显著恢复社交互动比率与蔗糖偏好，并缩短TST不动时间。
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LHA GABA能神经元TGR5通过抑制神经元过度兴奋发挥特异性抗抑郁作用
为了明确TGR5对LHA GABA能神经元兴奋性的调控作用，作者在GAD2-Cre小鼠LHA中注射AAV2/9-DIO-shRNA(Gpbar1)-mCherry以特异性敲低GABA能神经元中的TGR5，或给予TGR5拮抗剂SBI-115。电生理与在体钙成像显示，敲低TGR5或给予SBI-115显著提高了LHA GABA能神经元的动作电位发放频率与社交区进入时的钙信号幅度，并阻断了半合成TGR5激动剂INT-777（10 μM）对神经元发放的抑制效应；在3天亚阈值社会挫败应激（SSDS）或亚阈值束缚应激（SRS）下，敲低LHA GABA能神经元TGR5或局部注射SBI-115均显著诱导出社交回避、快感缺失及绝望样行为。
反之，在GAD2-Cre小鼠LHA中特异性过表达TGR5（AAV-DIO-TGR5-mCherry）或向双侧LHA微量注射INT-777（1.5 μg/侧），均可显著压低CSDS易感小鼠和CRS小鼠LHA GABA能神经元的异常高频发放与在体钙反应，并逆转社交回避、TST不动时间延长和蔗糖偏好降低。相比之下，在Vglut2-Cre小鼠LHA谷氨酸能神经元中过表达TGR5并不能改善CSDS诱导的抑郁样行为；而利用hM3Dq化学遗传学激活LHA GABA能神经元则完全阻断了LHA注射INT-777的抗抑郁效应，证明TGR5的抗抑郁作用严格依赖于其对LHA GABA能神经元兴奋性的抑制。
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TGR5通过抑制ERK磷酸化恢复Kv4.2介导的瞬时外向A型钾电流
为进一步揭示TGR5调控LHA GABA能神经元内在兴奋性的离子通道机制，研究团队在脑片全细胞电压钳模式下分离记录了电压门控钠电流与钾电流。结果显示，INT-777灌流或TGR5过表达可特异性增大LHA GABA能神经元的瞬时外向A型钾电流（IA）密度，而不影响延迟整流钾电流或电压门控钠电流；反之，敲低TGR5则显著减小A型钾电流密度。信号通路筛查表明，慢性应激显著升高LHA中的ERK磷酸化水平（p-ERK，而p-PKA与p-AKT无显著变化），TGR5激活或过表达可逆转p-ERK升高；给予ERK抑制剂PD98059（而非PKA抑制剂H89）能够阻断TGR5拮抗剂SBI-115引起的A型钾电流减小与神经元高频发放。
在介导神经元A型钾电流的Kv4通道家族（Kv4.1、Kv4.2、Kv4.3）中，CSDS易感小鼠LHA GABA能神经元的Kv4.2总蛋白与膜蛋白水平特异性下调，而LHA注射INT-777可恢复Kv4.2表达。当在GAD2-Cre小鼠LHA中注射AAV-DIO-Kv4.2-shRNA-mCherry特异性敲低GABA能神经元Kv4.2后，INT-777不仅无法恢复A型钾电流或压低神经元发放频率，其在CSDS模型中改善社交互动、蔗糖偏好及悬尾不动时间的抗抑郁效应也被完全阻断（这一LHA GABA能神经元的ERK-Kv4.2通路有别于团队此前发现的dCA3区CaMKIIα神经元中TGR5经PKA/CREB与L型钙通道发挥作用的机制）。
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LHA GABA能神经元通过单突触抑制背侧海马dCA3区CaMKIIα能神经元调控抑郁样行为
为锁定LHA GABA能神经元调控抑郁样行为的关键下游靶区，作者对LHA GABA能神经元投射的5个下游核团（dCA3、CPU、Acb、LPO、PAG）轴突末梢进行了在体光纤钙记录，发现仅投射至背侧海马CA3区（dCA3）的轴突末梢在CSDS易感小鼠进入社交区域时出现显著的钙信号升高。顺行跨单突触示踪（LHA注射AAV2/1-Cre并在dCA3注射DIO-mCherry）显示91.83%的dCA3突触后神经元为CaMKIIα阳性兴奋性神经元；在Vglut2-Cre小鼠dCA3中开展的狂犬病毒（RV）逆行跨单突触示踪同样证实97.24%的上游LHA输入神经元为GABA能神经元。脑片膜片钳记录表明，465 nm蓝光激活LHA来源的ChR2阳性轴突末梢可在dCA3神经元中诱发出对TTX + 4-AP耐受、可被GABAA受体拮抗剂印防己毒素（picrotoxin）完全阻断的单突触抑制性突触后电流（eIPSCs）。
在利用AAV-DIO-taCaspase3消融dCA3本地GABA能中间神经元以排除局部微环路干扰后，作者通过植入dCA3的Inper套管光纤对LHAGABA→dCA3CaMKIIα通路进行在体光遗传学双向操控：465 nm蓝光（20 Hz）激活该通路不仅诱发实时位置厌恶（RTPA），还在亚阈值应激（SSDS）下直接诱导出抑郁样行为；而589 nm黄光激活NpHR抑制该通路，则能通过降低突触前GABA释放概率（成对脉冲比率PPR升高）产生持续至少2周的长效抗抑郁作用。相反，在消融dCA3区CaMKIIα神经元后单独光激活LHAGABA→dCA3GABA通路则不诱发抑郁样行为。
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接收LHA输入的dCA3谷氨酸能神经元通过投射至背外侧隔核GABA能神经元介导抗抑郁效应
为进一步明确接收LHA输入的dCA3神经元向下游何处输出以调控抑郁行为，研究团队在LHA注射顺行跨突触AAV2/1-Cre并在dCA3注射DIO-EYFP，发现dCA3突触后神经元的轴突密集投射至背外侧隔核（DLS），且其轴突末梢紧密包绕DLS内的GABA能神经元。结合DLS注射retro-CaMKIIα-Cre与dCA3狂犬病毒（RV）跨突触逆行示踪，证实了LHAGABA→dCA3CaMKIIα→DLS三级环路的解剖学连接；脑片膜片钳记录显示，光激活接收LHA输入的dCA3轴突末梢可在DLS GABA能神经元中诱发出对TTX + 4-AP耐受、可被AMPA受体拮抗剂CNQX阻断的单突触兴奋性突触后电流（eEPSCs）。
在功能验证中，利用465 nm蓝光激活接收LHA输入的dCA3→DLS投射末梢（AAV2/1-Cre注入LHA，AAV-DIO-ChR2-mCherry注入dCA3，光纤植入DLS），可显著提高CSDS易感小鼠的社交互动比率与蔗糖偏好，并缩短TST不动时间；而当在DLS投射型dCA3 CaMKIIα神经元中表达抑制性hM4Di并通过DLS套管微量注射CNO抑制该下游通路时，原本由589 nm黄光抑制LHAGABA→dCA3通路所产生的抗抑郁行为学改善被完全消除，证明dCA3CaMKIIα→DLSGABA通路是介导LHAGABA→dCA3抗抑郁效应的必要下游输出。
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LHA局部激活TGR5重塑突触可塑性并经LHA→dCA3→DLS三级环路发挥抗抑郁作用
最后，研究团队在完整环路层面验证了靶向LHA TGR5的药理学干预机制。连续3天向CSDS易感小鼠LHA局部微注射TGR5激动剂INT-777（1.5 μg，200 nL/侧），可显著逆转LHA投射靶向的dCA3 CaMKIIα+神经元上自发抑制性突触后电流（sIPSC）频率的升高（不影响sEPSC）。同时，利用投射特异性的Supernova稀疏标记系统（dCA3注射retro-AAV-GAD1-Cre，LHA注射AAV-DIO-YPet-mGFP）进行三维树突棘重建发现，CSDS易感小鼠投射至dCA3的LHA GABA能神经元总树突棘密度及成熟蘑菇型（mushroom）树突棘密度显著增加、细长型（thin）树突棘减少，而LHA局部给予INT-777可逆转这一结构可塑性重塑。
在行为学闭环验证中，无论是通过化学遗传学激活GAD2-Cre小鼠LHA→dCA3 GABA能投射末梢（LHA表达AAV-DIO-hM3Dq-mCherry并在dCA3微注射CNO），还是在Vglut2-Cre小鼠中化学遗传学抑制下游dCA3→背外侧隔核（DLS）谷氨酸能投射（dCA3表达AAV-DIO-hM4Di-mCherry并在DLS微注射CNO），均能完全阻断LHA局部给予INT-777带来的抗抑郁行为改善。上述结果完整确立了“LHA TGR5/ERK/Kv4.2 → LHA GABA能神经元 → dCA3 CaMKIIα+神经元 → DLS GABA能神经元”三级环路在雄性小鼠抑郁样行为中的核心调控作用。