难标记的投射通路，如何兼顾逆行示踪与活体钙记录？
小鼠研究围绕CVS-N2c-ΔG狂犬病毒载体体系，在纹状体上游通路与对侧海马比较逆行标记和单突触示踪效率，并在伏隔核投射通路验证三周内的糖水奖赏钙信号记录与位点特异性重组表达。
想要弄清一个脑区究竟接收哪些上游输入、这些投射神经元又在行为中如何活动，研究者往往需要逆行病毒示踪工具既“追得全”，又让神经元保持足够好的生理状态来完成活体记录。2022年10月24日在线发表于 Neural Regeneration Research 的一项小鼠研究，围绕CVS-N2c-ΔG狂犬病毒载体体系展开系统验证：在rAAV9-Retro难以充分覆盖的中脑至背外侧纹状体通路上，N2cG包膜载体的逆行标记细胞数提升至约6倍；在海马单突触跨突触示踪中，其收敛指数约为传统SAD-B19-ΔG体系的3倍，并在腹侧被盖区至伏隔核通路上维持了21天内的奖赏钙响应记录。
在小鼠背外侧纹状体逆行追踪中，N2cG包膜CVS-N2c-ΔG标记的VTA/SNc神经元数量约为rAAV9-Retro的6倍；配合oG介导单突触示踪时，对侧腹侧海马收敛指数约为SAD-B19-ΔG的3倍，并可在VTA→NAc投射通路支持至少21天的活体钙信号监测与双侧运动皮层Cre/Flpo重组。
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逆行标记不仅要追到上游，还要留出活体观测窗口
解析脑网络的输入与输出关系，离不开轴突末梢吸收的逆行病毒载体和跨单突触示踪体系。常用的重组腺相关病毒逆行载体（如rAAV2-Retro与rAAV9-Retro）在不少皮层与皮层下通路中表现稳定，但仍存在脑区选择性，对中脑多巴胺能相关核团投射向背外侧纹状体等通路的标记效率偏弱。
另一类常用的糖蛋白缺失型狂犬病毒载体中，传统疫苗株SAD-B19-ΔG具备跨单突触追踪能力，但较高的细胞毒性限制了钙探针或光遗传元件的较长周期功能检测；减毒株CVS-N2c-ΔG虽然降低了神经元毒性并提升了跨突触效率，却受限于既往漫长的制备周期与滴度瓶颈。研究团队在建立改进型BHK-21衍生细胞制备体系后，重点在成年小鼠脑内检验了这套CVS-N2c-ΔG工具包在多脑区逆行投射标记、单突触输入追踪、活体钙活动监测和重组酶递送中的表现。
从腹侧被盖区出发，逆行呈现皮层与皮层下多处输入源
研究首先检验了N2cG糖蛋白包膜的CVS-N2c-ΔG病毒在成年C57BL/6小鼠脑内的长距逆行标记能力。将携带红色荧光蛋白的病毒与指示注射位点的绿色CTB-488混合注入腹侧被盖区（VTA）后，不仅原位神经元呈现清晰感染，多个已知向VTA发出投射的上游脑区也出现了密集的逆行标记细胞。
组织学切片显示，逆行标记信号广泛分布于躯体运动皮层与前扣带皮层、伏隔核、内侧视前区、下丘脑前核、外侧缰核、外侧下丘脑区、未定带、中缝背核以及臂旁核等区域，验证了N2cG包膜载体沿轴突末梢逆行进入多群上游投射神经元的能力。
来源：Lin KZ et al. · Neural regeneration research · CC BY-NC-SA
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同位点混合对比：中脑至纹状体投射标记数量提升至约6倍
为了直接评估该工具在传统AAV逆行载体表现受限通路中的效率，研究选取了腹侧被盖区与黑质致密部（VTA/SNc）投射至背外侧纹状体（DLS）的通路。实验将表达tdTomato的N2cG包膜CVS-N2c-ΔG与表达EGFP的rAAV9-Retro混合后，共同注入同一批小鼠的背外侧纹状体。
在VTA/SNc区域，rAAV9-Retro仅标记出少量绿色荧光细胞（平均38.33 ± 0.88个），而N2cG包膜的CVS-N2c-ΔG驱动了大量投射神经元表达红色荧光，阳性细胞总数达到262.30 ± 4.06个，约为同位点rAAV9-Retro标记数量的6倍（P < 0.0001）。这一同鼠双通道对照表明，该载体能够有效覆盖rAAV9-Retro难以充分进入的黑质纹状体与中脑边缘纹状体投射神经元。
来源：Lin KZ et al. · Neural regeneration research · CC BY-NC-SA
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配合oG辅助系统，对侧海马跨单突触收敛指数达SAD-B19-ΔG的3倍
在细胞类型特异性的逆行跨单突触示踪中，不同毒株与不同糖蛋白辅助系统的组合会直接影响上游输入网络的检出率。研究先在普通C57BL/6小鼠腹侧海马（vHPC）单独注射EnvARVG假型化狂犬病毒，确认无TVA受体时不产生局部泄漏感染；随后在Thy1-Cre转基因小鼠腹侧海马先行注入携带TVA与密码子优化巴斯德株糖蛋白（oG）的AAV辅助病毒，3周后同位点分别注入EnvARVG假型化的CVS-N2c-ΔG或SAD-B19-ΔG。
以对侧腹侧海马输入神经元数量与注射侧共标起始细胞（starter cells）数量的比值计算收敛指数，oG介导的CVS-N2c-ΔG收敛指数达到1.87 ± 0.16，约为oG介导SAD-B19-ΔG（0.60 ± 0.06）的3倍（P = 0.0014）。作者进一步比较不同糖蛋白补偿方案发现，CVS-N2c-ΔG配合oG或自身N2cG在对侧海马具有相近的收敛指数（1.87 ± 0.16对比1.95 ± 0.15，P = 0.7337）；在D2R-Cre小鼠纹状体输入追踪中，密码子修饰版optiG与N2cG在皮层、基底外侧杏仁核及丘脑的收敛指数也未见显著差异，说明oG与N2cG均能支持CVS-N2c-ΔG完成高效率跨单突触输入映射。
来源：Lin KZ et al. · Neural regeneration research · CC BY-NC-SA
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逆行携带GCaMP6s：在奖赏通路上连续三周捕获糖水钙瞬变
除了描绘解剖连接，研究进一步检验了N2cG包膜的CVS-N2c-ΔG载体能否为特定投射神经元提供足够长的活体生理记录窗口。作者构建了表达钙指示剂GCaMP6s的CVS-N2c-ΔG载体并注入小鼠伏隔核（NAc），同时在直接上游脑区腹侧被盖区（VTA）植入光纤，在给予5%糖水奖赏的行为任务中采集VTA→NAc投射神经元的钙信号变化。
在病毒注射后第7天、第14天和第21天三个时间点，小鼠舔舐糖水时均能在VTA逆行标记的投射神经元群中记录到清晰的ΔF/F钙信号升高。这表明由该体系制备的CVS-N2c-ΔG载体不仅能完成高效率逆行转导，还能在至少21天的时间窗口内维持投射神经元对自然奖赏刺激的功能响应。
来源：Lin KZ et al. · Neural regeneration research · CC BY-NC-SA
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支持双侧皮层Cre与Flpo重组，长期减毒优化仍有空间
为了拓展条件性基因操控场景，研究还在成年小鼠一侧初级运动皮层（M1）分别注入Cre依赖或Flpo依赖的EGFP报告AAV，并在对侧M1注入携带mCherry-2A-Cre或mCherry-2A-Flpo的N2cG包膜CVS-N2c-ΔG载体。组织学图像显示，两种逆行载体均能跨胼胝体逆行转导并在注射侧M1高效开启绿色EGFP表达，与红色mCherry信号高度共标。
综合来看，这套CVS-N2c-ΔG工具包在rAAV9-Retro标记受限的通路逆行覆盖、oG/N2cG介导的单突触示踪、21天活体钙信号记录以及Cre/Flpo重组酶递送中均展现出实用价值。同时作者也明确指出，工程化CVS-N2c-ΔG载体的神经毒性虽较传统株降低并可维持3周功能监测，但尚未完全消除；针对更长周期的慢性行为实验，进一步减毒与跨病毒工具组合仍是后续改进方向。
来源：Lin KZ et al. · Neural regeneration research · CC BY-NC-SA
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