2023年2月20日，浙江中医药大学第四临床医学院、浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院及西湖实验室张红海（HongHai Zhang）团队（王玉玲、徐晴、余倩、顾乐媛（LeYuan Gu）为共同第一作者，马海翔等共同参与）在《STAR Protocols》发表题为“Protocol for modulation of the serotonergic DR-PBC neural circuit to prevent SUDEP in the acoustic and PTZ-induced DBA/1 mouse models of SUDEP”的实验方案论文。作为该团队此前在《iScience》（Ma et al., 2022）发表成果的配套方法学文献，本文围绕癫痫猝死（SUDEP）的主要致死因素——癫痫诱发呼吸骤停（S-IRA），系统阐述了在听源性发作与戊四氮（PTZ）诱导的两类DBA/1小鼠模型中，联合开展脑立体定位病毒投递、脑室与核团双侧置管给药、神经逆行示踪、光遗传学调控以及自由活动双色光纤钙信号记录的完整实验流程。

01 / 结果 01

DBA/1小鼠双模态SUDEP模型构建与逆行环路示踪设计

癫痫诱发呼吸骤停（S-IRA）是导致癫痫猝死（SUDEP）的核心病理生理环节。研究团队在此前工作中发现，增强中缝背核（DR）五羟色胺（5-HT）能神经元功能可显著降低DBA/1小鼠模型的S-IRA发生率，而延髓腹侧呼吸柱中的前包钦格复合体（PBC）是调控呼吸节律的关键核团。为在可重复的动物模型中解析DR—PBC五羟色胺能神经环路，该方案首先规范了DBA/1小鼠的两类诱导模型：一是在出生后26至28天连续3至4天予以声刺激（96 dB SPL）致敏，至8周龄时诱发听源性惊厥（AGSz）及随后的S-IRA；二是在未经声致敏的8周龄DBA/1小鼠中通过腹腔注射戊四氮（PTZ，75 mg/kg）诱发全面性发作与呼吸骤停。

由于DBA/1小鼠对环境声音与温度高度敏感（低温或环境噪声暴露会干扰听源性发作易感性及S-IRA发生率），方案强调在饲养、转运与实验全过程中维持恒温（25–26 °C）与隔音环境。为在解剖学层面验证DR与PBC之间的投射联系，方案采用神经逆行示踪剂CTB-555分别对DR（AP −4.55 mm，ML −0.44 mm，DV −2.80 mm，右侧倾斜10°）与双侧PBC（AP −6.80 mm，ML −1.25 mm，DV −4.95 mm）开展立体定位微量注射，通过单侧或双侧注射后约1周的脑片荧光信号分布确认DR与PBC之间的双向解剖投射关系。

原论文图 4中缝背核（DR）与前包钦格复合体（PBC）的CTB-555逆行示踪位点与投射示意图

02 / 结果 02

中缝背核斜向光纤植入与侧脑室给药脑电同步监测

针对中缝背核（DR）正上方血管密集、垂直进针极易引发大出血并导致小鼠术后死亡的技术难点，该方案特别设计了右侧倾斜10°的立体定位入路：先按坐标（AP −4.55 mm，ML −0.44 mm，DV −2.80 mm，右倾10°）以20 nL/min的恒定速率向DR微量注射100 nL携带有色氨酸羟化酶2（TPH2）启动子的光遗传学病毒（pAAV-TPH2-PRO-ChETA-EYFP-WPRES-PAS），留针10分钟以确保病毒充分扩散；随后在同一斜向轨迹上、注射位点上方0.05 mm处（DV −2.75 mm，右倾10°）植入陶瓷插芯光纤，从而在有效避开中线血管窦的同时实现对DR五羟色胺能神经元的精准蓝光激活。

为验证外周补充5-羟色氨酸（5-HTP）或光遗传激活DR五羟色胺能神经元对S-IRA的抑制效应是否依赖于中枢5-HT2A受体，方案还在右侧侧脑室（ICV，AP −0.45 mm，ML −1.00 mm，DV −2.50 mm）植入导轨套管以微量注射5-HT2A受体拮抗剂酮色林（KET，18.30 nmol），并配合颅骨固定螺钉与皮层脑电（EEG）电极同步记录阵挛与强直发作波形。实验结果表明，侧脑室注射KET可显著逆转5-HTP给药或DR光遗传激活所带来的S-IRA发生率下降。

原论文图 3中缝背核（DR）光纤植入与侧脑室（ICV）导轨套管置入方案

03 / 结果 03

中缝背核光遗传激活结合双侧前包钦格复合体微量给药

在明确侧脑室阻断5-HT2A受体可逆转DR光刺激的保护作用后，为进一步将下游效应核团精确定位至前包钦格复合体（PBC），该方案设计了“DR光遗传激活 + 双侧PBC导轨套管微量给药”的联合操控实验。手术在同一只DBA/1小鼠中完成DR的TPH2-ChETA病毒注射与10°斜向光纤植入，并针对双侧PBC核团（图谱靶点坐标 AP −6.80 mm，ML −1.25 mm，DV −4.95 mm），在其上方0.05 mm处（DV −4.90 mm）对称植入双侧导轨套管，以牙科水泥与锚定螺钉稳固封固。

经过至少3周的病毒表达期后，实验人员在蓝光激活DR五羟色胺能神经元（465 nm，20 Hz，20 ms脉宽，15 mW，持续20分钟）之前，通过双侧PBC导轨套管微量注射酮色林（KET），随后给予腹腔注射PTZ并借助摄像系统定量评估狂奔与阵挛发作持续时间、全面性发作潜伏期、发作评分以及强直—阵挛发作与S-IRA发生率。结果显示，双侧PBC局部微量注射KET即可显著逆转DR光遗传激活对PTZ诱发S-IRA的抑制作用，证实DR五羟色胺能投射主要通过激活PBC内的5-HT2A受体来维持发作期呼吸功能。

原论文图 5中缝背核（DR）光纤植入联合双侧前包钦格复合体（PBC）导轨套管置入方案

04 / 结果 04

前包钦格复合体双侧光纤与导轨套管联合干预配置

除在DR胞体端施加光刺激外，该方案还提供了直接在前包钦格复合体（PBC）开展双侧病毒投递、双侧光纤植入与双侧导轨套管给药的操作规范（图7）。在这一配置中，实验人员向双侧PBC（AP −6.80 mm，ML −1.25 mm，DV −4.95 mm）微量注射pAAV-TPH2-PRO-ChETA-EYFP-WPRES-PAS，并在核团上方0.05 mm处（DV −4.90 mm）对称植入光纤，或植入双侧导轨套管及配套注射内针、假芯与保护帽，以在PBC局部水平实现光遗传调控与药理学受体阻断的组合测试。

术后组织学验证环节中，内源性增强型黄色荧光蛋白（EYFP）无需免疫组化染色即可直接呈现绿色荧光信号，同时结合色氨酸羟化酶2（TPH2）、神经元活性标志物c-fos以及PBC特征性神经激肽-1受体（NK1R）免疫荧光染色，可在冷冻冠状切片（30 μm）上准确核验DR与双侧PBC内的光纤尖端及套管轨迹位置。

原论文图 7双侧前包钦格复合体（PBC）光纤与导轨套管植入方案

05 / 结果 05

中缝背核光刺激与双侧前包钦格复合体光纤钙信号记录

为了在自由活动小鼠中实时监测DR五羟色胺能环路激活对PBC神经元群体钙活动的影响，该方案构建了“DR光遗传刺激 + 双侧PBC光纤钙信号记录”的同步实验范式。手术在DR注射pAAV-TPH2-PRO-ChETA-EYFP-WPRES-PAS并植入激发光纤的同时，向双侧PBC（AP −6.80 mm，ML −1.25 mm，DV −4.95 mm）微量注射钙指示剂病毒AAV2/9-mCaMKIIa-GCaMP6f-WPRE-pA，并在双侧PBC上方0.05 mm处（DV −4.90 mm）植入钙信号记录光纤。

在正式记录前，实验人员提前两天抚触小鼠并使其在暗室记录箱内适应环境，每次插接光纤前均使用便携式光功率计校准陶瓷套管前端的465 nm输出光强；记录过程中采用黑色陶瓷插芯与黑色套管屏蔽环境杂散光，同时采集488 nm激发通道与410 nm等吸光点（isosbestic）参比通道信号，以扣除运动伪迹与背景噪声。在声刺激或PTZ诱发发作前后对比光刺激组与无光刺激组的阵挛期及强直期钙信号峰值（ΔF/F），从而在环路功能层面定量刻画DR至PBC五羟色胺能通路对呼吸中枢神经元群体活性的动态调控。

原论文图 6中缝背核（DR）光纤植入与双侧前包钦格复合体（PBC）钙信号记录光纤置入方案