同样面对入侵者，雄鼠与雌鼠的攻击开关为何走出不同路线？
小鼠研究比较下丘脑腹内侧核向后无名质发出的兴奋性与抑制性投射比例，揭示两性通过不同突触平衡调节攻击行为的环路机制。
在多数脊椎动物中，雄性通常比非哺乳期雌性表现出更高频、更剧烈的领地与同类攻击行为。下丘脑腹内侧核腹外侧部（VMHvl）表达雌激素受体α（Esr1）的神经元早已被确认为调控两性攻击行为的核心节点，但直接激活该核团为何在雄性中诱发猛烈攻击、在处女雌性中却几乎难以诱发攻击，其下游神经环路机制一直未获阐明。 2024年7月16日，浙江大学脑科学与脑医学学院、良渚实验室段树民院士与虞燕琴教授团队（共同第一作者为朱正刚、缪露）在《Neuron》发表题为“A hypothalamic-amygdala circuit underlying sexually dimorphic aggression”的研究论文。研究团队结合化学遗传学、光遗传学、跨突触病毒示踪、离体全细胞膜片钳记录、多通道光电极记录及在体光纤光度记录，发现VMHvl向基底前脑后无名质（posterior substantia innominata, pSI）同时发出谷氨酸能兴奋性投射和GABA能抑制性投射：雄性小鼠以兴奋性投射占绝对优势，而雌性小鼠则以抑制性投射占优势；这种突触连接与兴奋-抑制平衡（E/I balance）的性别二态性直接决定了两性攻击行为输出的差异。
本研究揭示了下丘脑VMHvl向基底前脑pSI发出的谷氨酸能与GABA能双投射在雄性和雌性小鼠之间存在显著的构成比例与突触强度差异，通过设定性别二态性的pSI兴奋-抑制平衡（E/I balance）直接控制两性攻击行为的开启与抑制，为理解本能社会行为的性别差异提供了清晰的环路范式。
阅读目录 · 7个部分
激活VMHvlEsr1神经元诱发雄性特异攻击并选择性招募下游pSI核团
研究团队首先在成年处女雄性和雌性Esr1-Cre小鼠的单侧VMHvl注射AAV-DIO-hM3Dq-mCherry，通过腹腔注射低剂量CNO（0.5 mg/kg）选择性激活VMHvlEsr1神经元。行为学测试显示，化学遗传学激活VMHvlEsr1神经元可使全部受试雄鼠对入侵者发起高频、长时程的撕咬攻击，但在处女雌鼠中完全不诱发攻击行为，仅引起少量社交互动或骑跨行为。
为排除社交互动反馈本身的干扰，研究者在独处状态下给予CNO并检测全脑c-Fos表达。结果显示，雄鼠与雌鼠VMHvl局部被激活的hM3Dq阳性神经元比例无显著差异；但在对比VMHvl下游9个主要投射靶区（AHN、MPOA、DMH、PVN、vlPAG、pSI、AVPV、dmPAG、lPAG）时，后无名质（pSI）表现出最显著的雄性偏向性c-Fos激活——雄鼠pSI的c-Fos阳性细胞密度显著高于雌鼠，提示VMHvl向pSI的信息传递存在关键的性别差异。
来源： et al. · Neuron · Original figure reproduced for academic literature review under fair scholarly commentary; copyright remains with the authors/publisher.
查看原图与英文图注 ↗
pSI是介导VMHvl诱发雄性攻击行为的必需下游核团
研究团队利用顺行突触前示踪病毒AAV-FLEX-EGFP-2A-Synaptophysin-mRuby证实，雄鼠VMHvlEsr1神经元在同侧pSI内形成密集的突触前终末分布。为检验pSI在VMHvl诱发攻击中的必要性，研究者在雄性Esr1-Cre小鼠单侧VMHvl表达DIO-hM3Dq的同时，在双侧pSI表达光遗传抑制通道AAV-hSyn-hGtACR1-EGFP。CNO激活VMHvl可诱发强烈攻击，而对pSI施加蓝光抑制则能可逆地阻断该攻击行为。
鉴于团队此前发现pSI中表达Thy1的神经元（pSIThy1）是驱动攻击的核心群体，研究者进一步在Thy1-Cre雄鼠中采用逆行跨突触组合策略：在单侧pSI注射retroAAV-FLEX-Flpo并在同侧VMHvl注射AAV-fDIO-ChR2-EYFP以特异性操控投射至pSI的VMHvlThy1神经元，同时在pSI表达AAV-DIO-hM4Di-mCherry。光激活投射至pSI的VMHvlThy1轴突终末可可靠诱发攻击，而CNO化学遗传学抑制pSIThy1神经元则显著阻断了这一光诱发攻击反应。
来源： et al. · Neuron · Original figure reproduced for academic literature review under fair scholarly commentary; copyright remains with the authors/publisher.
查看原图与英文图注 ↗
VMHvl通过单向支配pSI-PAG通路驱动攻击行为
中脑导水管周围灰质（PAG）是控制攻击动作执行的重要下游中枢。研究团队在雄鼠单侧VL/LPAG注射retroAAV-hSyn-Cre-EGFP，并在同侧pSI注射Cre依赖的TVA、RG及缺陷型狂犬病病毒RV-EnvA-ΔG-dsRed，逆行单突触示踪显示投射至PAG的pSI神经元（pSI-PAG）直接接收来自同侧VMHvl的丰富单突触输入。离体脑片全细胞记录进一步证实，光激活表达ChR2的VMHvlCaMKII投射终末可在75%（12/16）的逆行标记pSI-PAG神经元中诱发兴奋性突触后电流（EPSCs）及动作电位发放。
为了明确VMHvl与pSI在攻击环路中的上下游层级关系，研究者在双侧VMHvl表达AAV-CaMKII-hM4Di-EGFP，同时在pSI-PAG神经元中表达AAV-DIO-ChR2-mCherry。在生理盐水对照条件下，雄鼠表现出正常的自发攻击行为；CNO抑制双侧VMHvlCaMKII神经元虽能完全消除雄鼠的自然自发攻击，却无法阻断直接光激活pSI-PAG神经元所诱发的强烈攻击行为，证明pSI位于VMHvl的功能下游并组成VMHvl→pSI→PAG单向层级环路。
来源： et al. · Neuron · Original figure reproduced for academic literature review under fair scholarly commentary; copyright remains with the authors/publisher.
查看原图与英文图注 ↗
VMHvl向pSI发出功能相反的兴奋性与抑制性双投射
通过RNAscope原位杂交与逆行示踪，研究团队发现雄鼠VMHvl中表达CaMKII的神经元约89%为VGLUT2阳性谷氨酸能神经元、约11%为VGAT阳性GABA能神经元。在单侧VMHvl注射AAV-CaMKII-ChR2-mCherry并在同侧pSI埋置光纤后，蓝光刺激VMHvlCaMKII–pSI投射终末可在脑片中诱发被DNQX和AP5阻断的谷氨酸能EPSC，并在在体条件下诱发雄鼠高频攻击，但在雌鼠中仍不能诱发攻击。
相反，当在VGAT-Cre雄鼠中利用投射特异策略选择性操控投射至pSI的VMHvl GABA能神经元（VMHvlVGAT–pSI）时，光纤光度记录显示光激活该抑制性通路会迅速压低pSI神经元的GCaMP6m钙信号；在行为上，光激活VMHvlVGAT–pSI投射不仅不诱发攻击，反而能在3秒内迅速终止雄鼠正在进行的自发攻击；而利用fDIO-hM4Di化学遗传学抑制该通路则显著延长并增强了雄鼠的自发攻击（在雌鼠中抑制该通路仍不足以直接诱发攻击）。
来源： et al. · Neuron · Original figure reproduced for academic literature review under fair scholarly commentary; copyright remains with the authors/publisher.
查看原图与英文图注 ↗
光激活VMHvlEsr1–pSI通路在两性中引发截然不同的攻击表型
为进一步直接比较VMHvlEsr1–pSI通路在两性中的行为效应，研究者在雄性和雌性Esr1-Cre小鼠单侧VMHvl注射AAV-DIO-ChR2-EYFP，并在同侧pSI上方植入光纤。光刺激雄鼠VMHvlEsr1–pSI投射终末可高度可靠地诱发针对入侵者的猛烈攻击（不伴随交配骑跨），且攻击发生率与强度随蓝光功率及频率升高而增强。
相比之下，在同等光刺激参数下，激活雌鼠VMHvlEsr1–pSI投射终末仅在少数试次中诱发潜伏期长、持续时间极短的轻微攻击，无论面对雄性还是雌性入侵者均远弱于雄鼠。研究者进一步监测了雌鼠动情前期（P）、动情期（E）、动情后期（M）与动情间期（D）的阴道涂片周期，发现光刺激VMHvlEsr1–pSI通路引发的低水平攻击反应在动情周期的四个阶段之间并无显著变化。
来源： et al. · Neuron · Original figure reproduced for academic literature review under fair scholarly commentary; copyright remains with the authors/publisher.
查看原图与英文图注 ↗
VMHvl–pSI环路兴奋/抑制突触输入比例呈显著性别二态性
为何同一解剖通路在两性中产生截然不同的行为输出？研究团队利用VGLUT2-Cre和VGAT-Cre小鼠进行顺行突触前终末定量，并结合pSIThy1神经元单突触狂犬病病毒逆行示踪与多重荧光原位杂交（RNAscope），揭示了显著的解剖学性别差异：在雄鼠中，投射至pSI的VMHvlEsr1神经元高达77.81%为VGLUT2阳性谷氨酸能神经元、仅16.15%为VGAT阳性GABA能神经元；而在雌鼠中，投射至pSI的VMHvlEsr1神经元有52.11%为VGAT阳性GABA能神经元、仅39.04%为VGLUT2阳性谷氨酸能神经元。
离体脑片全细胞电压钳记录进一步在同一pSI神经元上分别钳制于-70 mV记录光诱发EPSC（可被CNQX+AP5阻断）、钳制于0 mV记录光诱发IPSC（可被bicuculline阻断），并通过TTX+4-AP验证其单突触性质。电生理结果显示，雄鼠VMHvlEsr1–pSI通路的光诱发EPSC幅值是雌鼠的2.2倍以上，而雌鼠的光诱发IPSC幅值是雄鼠的2.5倍以上且潜伏期更短，致使雄鼠pSI神经元接收到的兴奋/抑制比值（E/I ratio）远高于雌鼠。
来源： et al. · Neuron · Original figure reproduced for academic literature review under fair scholarly commentary; copyright remains with the authors/publisher.
查看原图与英文图注 ↗
在体钙信号与单细胞电生理证实pSI对VMHvl输入的性别差异化整合
为验证上述突触E/I差异在清醒动物脑内的整合效果，研究团队在Esr1-Cre小鼠VMHvl表达红移视蛋白AAV-DIO-ChrimsonR-tdTomato，并在同侧pSI表达AAV-hSyn-GCaMP6m，借助植入式光纤与双色光纤记录系统同步开展红光刺激与钙信号记录。在1、5、10 mW不同功率635 nm红光刺激下，雄鼠pSI群体钙信号（ΔF/F）均呈现强烈且随功率递增的兴奋性上升，而雌鼠pSI钙信号响应幅值显著低平。
进一步利用32通道光电极（optrode）在清醒小鼠pSI记录单神经元放电显示，光刺激VMHvlEsr1神经元或pSI终末时，雄鼠pSI中绝大部分响应神经元表现为放电频率显著升高的兴奋性反应，仅极少数神经元被抑制；而在雌鼠pSI中，兴奋性响应神经元比例与放电增量均显著低于雄鼠，且随光功率增加有更高比例的pSI神经元表现为放电受抑。这一结果完整闭环了从分子细胞类型、单突触E/I比例到在体群体编码与两性攻击行为表型的因果链条。
来源： et al. · Neuron · Original figure reproduced for academic literature review under fair scholarly commentary; copyright remains with the authors/publisher.
查看原图与英文图注 ↗